Полезное:
Как сделать разговор полезным и приятным
Как сделать объемную звезду своими руками
Как сделать то, что делать не хочется?
Как сделать погремушку
Как сделать так чтобы женщины сами знакомились с вами
Как сделать идею коммерческой
Как сделать хорошую растяжку ног?
Как сделать наш разум здоровым?
Как сделать, чтобы люди обманывали меньше
Вопрос 4. Как сделать так, чтобы вас уважали и ценили?
Как сделать лучше себе и другим людям
Как сделать свидание интересным?
Категории:
АрхитектураАстрономияБиологияГеографияГеологияИнформатикаИскусствоИсторияКулинарияКультураМаркетингМатематикаМедицинаМенеджментОхрана трудаПравоПроизводствоПсихологияРелигияСоциологияСпортТехникаФизикаФилософияХимияЭкологияЭкономикаЭлектроника
|
Приготовление питательной среды и ее стерилизацияПри выборе сырья учитывают не только физиологические потребности выбранного продуцента, но и стоимость сырья. Стоимость сырья для приготовления питательных сред составляет от 45 % (в производстве ферментов) до 65 % (в производстве этанола) себестоимости целевых и побочных продуктов ферментации. Основным компонентом питательных сред для культивирования организмов, вообще, и микроорганизмов, в частности, является углеродный субстрат (в клетках содержится в среднем 50 % (масс.) углерода). Источниками углерода (в порядке снижения легкости усвоения) служат: 1) углеводы, особенно гексозы (глюкоза, сахароза) 2) карбоновые кислоты (ацетат, пропионат, сукцинат) 3) многоатомные спирты (глицерин, маннит) и низкомолекулярные спирты (метанол, этанол) 4) углеводороды (н-алканы) 5) побочные продукты и отходы других производств, в частности: - меласса (43-57 % сахарозы, отход производства сахара) - отходы деревообрабатывающей промышленности и сельского хозяйства (гидролизаты древесины и растительного сырья) - сульфитный щёлок (отход ЦБК), содержит до 3,5 % сбраживаемых сахаров - зерновая и картофельная барда (отход спиртовых заводов) - молочная сыворотка и другие. Другие субстраты – компоненты питательных сред, обеспечивают потребность организмов в минеральном питании. К основным химическим элементам минерального питания относятся: - азот (в клетках бактерий его содержание достигает 12 %, грибов – до 10 %; при этом бактерии более требовательны к источникам азота, а потребность в нем заканчивается в первые 6-12 часов роста). Источники азота в составе питательных сред могут быть неорганическими (соли аммония, нитраты) и/или органическими (мочевина, аспарагин, пептон); - фосфор (входит в состав нуклеиновых кислот, фосфолипидов, АТФ, в сумме составляет около 3 % клеточной массы). Источниками фосфора в составе питательных сред выступают обычно фосфаты, гидро- и дигидрофосфаты (HPO42-, H2PO4-). Кроме углерода, азота и фосфора к макроэлементам, которые входят в состав основных компонентов питательных сред, относят еще 7-8 химических элементов: кислород (20 % биомассы), водород (8 %), сера (1 %), калий (до 1 %), натрий (до 1 %), магний (до 0,5 %), кальций (до 0,5 %). Кроме макроэлементов питательные среды должны содержать микроэлементы: Zn, Mn, Cl, Mo, Se, Co, Cu, Fe, Cr, W, Ni и др. Их концентрация в составе питательных сред составляет 10-3-10-4 моль (до 0,3 %). Они необходимы для построения ферментных систем, а их источниками являются водорастворимые соли. Ниже приведена типовая рецептура минерального питания для синтеза 30 г/л биомассы: (NH4)2SO4 12 г/л KH2PO4 1,3 г/л MgSO4 1,5 г/л Др. макроэлементы – по 10-3 г/л Микроэлементы – по 10-4 г/л
В полноценных питательных средах присутствуют так называемые факторы роста (комплексные обогатители питательных сред). К ним относят, прежде всего, витамины и аминокислоты (обязательны для ауксотрофов – микроорганизмов, неспособных к биосинтезу витаминов, чаще всего группы В – тиамина, никотиновой кислоты, пантотеновой кислоты, пиридоксина, инозита, биотина либо незаменимых аминокислот). Источники факторов роста при культивировании микроорганизмов – кукурузный экстракт, дрожжевой автолизат, молочная сыворотка, мясной экстракт и экстракт пшеничных отрубей, пептон. При культивировании клеток животных в состав питательных сред включают плазму крови, экстракт плаценты, растений и высших грибов, экстракты тыквы, листьев хлопчатника, отвар слив и т.п. Они являются источником стимуляторов и регуляторов роста (инсулина, гидрокортизона, простогландинов – для животных клеток; индолуксусной кислоты, гибберелловой кислоты – для растительных клеток). Кроме того, в состав питательных сред обычно входят химические пеногасители: - жировые, такие как растительное масло (вносят в больших количествах от 0,2 до 1 % (об.)); - синтетические (силиконы, пропинолы и др.). Питательные среды могут быть классифицированы: 1) по составу: - натуральные (комплексные), которые включают продукты животного или растительного происхождения и являются сложными и непостоянными по составу. К ним относятся мелассная среда, кукурузный экстракт или мясо-пептонный бульон. - синтетические: составляются из определенных химических соединений – источников макро- и микроэлементов, факторов роста. Они являются более дорогими, менее продуктивными, но имеют постоянный состав. 2) по физическому состоянию: - твердые: а) плотные, агаризованные; б) сыпучие (увлажненные отруби, солома, опилки); - жидкие; - газообразные. Стерилизация питательных сред осуществляется с целью уничтожения посторонних микроорганизмов и их спор для дальнейшего проведения процесса культивирования в асептических условиях. Различают холодную стерилизацию и стерилизацию путем термообработки питательных сред. К холодной стерилизации относятся следующие методы: - химическое воздействие (дезинфекция), например, β-пропиолактоном, 0,1-1 % (об.) раствор которого необратимо инактивирует микроорганизмы и их споры. Далее β-пропиолактон самопроизвольно гидролизуется до карбоновых кислот, являющихся дополнительным субстратом: СН2 СН2 + Н2О СН3СН2СООН О СО - ультрафильтрация через мембранные полипропиленовые, нейлоновые, ацетатцеллюлозные фильтры, размер пор которых составляет не более 0,45 мкм; - ультрафиолетовое облучение; - ультразвуковое воздействие (сверхнизкое и сверхвысокое, резонансные частоты). Применение методов холодной стерилизации связано с удобством их использования в лабораторной практике для обработки небольших количеств питательных сред. Ограничения для использования методов холодной стерилизации связаны с высокой стоимостью и небольшим выбором дезинфектантов, мембранных фильтров, неэффективностью использования УФ-воздействия для цветных и мутных сред, а также высокими энергозатратами на ультразвуковую обработку. Термическая стерилизация предполагает прогрев питательных сред при температурах выше температуры кипения. К методам термической стерилизации относятся: - автоклавирование - кипячение - стерилизация острым или глухим водяным паром. Устойчивость микроорганизмов к термическому воздействию иллюстрируют значения коэффициента термостабильности различных микроорганизмов: - вегетативных клеток бактерий и дрожжей 1 - вирусов 1-5 - спор микромицетов 2 × 10 - спор бактерий 3 × 106. Выбор температуры и продолжительности стерилизации определяется не только надежностью гибели посторонних микроорганизмов, но и сохранением качества питательной среды. Надежность стерилизации определяется достижением коэффициента выживания N/N0=10-16, где N и N0 – число клеток после и до стерилизации соответственно. Из данных таблицы 1 следует, что кратковременные высокотемпературные режимы стерилизации быстрее инактивируют споры бактерий и не вызывают значительных изменений в составе питательной среды. Зависимость константы скорости гибели от температуры носит экспоненциальный характер, поэтому с увеличением температуры на 10 0С скорость отмирания микроорганизмов увеличивается в 10 раз. Продолжительность стерилизации менее значимо влияет на ее эффективность (критерий стерилизации пропорционален времени стерилизации). К тому же продолжительные прогревы ведут к росту эксплуатационных затрат, а также к потере качества среды. Для сохранения качества среды компоненты синтетических питательных сред стерилизуют раздельно или используют мягкие режимы стерилизации. Таблица 1 – Влияние температуры и продолжительности стерилизации на стерильность и состав питательной среды (на примере Вacillus stearothermophylus)
|